نام اختصاری: BCR/ABL, RT PCR
سایر نام ها:
CML RT-PCR, BCR/ABL – P210 mRNA Detection, Philadelphia Chromosome Bone Marrow/Blood, BCR/ABL RNA-Qual Diagnostic
بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)
نوع نمونه قابل اندازه گیری: خون محیطی
حجم نمونه مورد نیاز: خون تام (whole blood) 5 ml
شرایط نمونه گیری:
نیاز به ناشتایی نمی باشد.
نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.
ملاحظات نمونه گیری:
از ظرف های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.
برای جمع آوری خون از لوله های استریل حاوی ماده ضد انعقاد EDTA یا سیترات استفاده شود.
پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.
پس از گرفتن نمونه خون باید لوله حاوی نمونه سانتریفیوژ شود و در ادامه پس از دور ریختن پلاسما، بافی کت به کمک سمپلر جدا شده و به حجم های کوچک تقسیم شود و سپس در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج RNA و PCR می باشد، در ºC20- نگهداری شود.
نمونه مناسب باید حاوی یک تا 10 میلیون گلبول سفید در هر 150 میکرولیتر باشد.
محل نمونه گیری از لحاظ خونریزی بررسی شود.
در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود (خون کامل را می توان حداکثر تا 72 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری و به آزمایشگاه منتقل نمود ولی از آنجا که در این تست با استفاده از روش RT – PCR باید میزان RNAی موجود در نمونه بیمار بررسی شود و از طرفی RNA نسبت به DNA مولکولی بسیار ناپایدار بوده و به سرعت تحت تأثیر آنزیم های آندونوکلئاز تخریب می شود، لذا بهتر است تا حد امکان بلافاصله پس از نمونه گیری برای انجام مراحل بعدی به آزمایشگاه ارسال گردد).
سطوح کار باید همواره قبل از شروع و پس از پایان کار با دستمال آغشته به الکل 70% و یا وایتکس 10% تمیز شود.
موارد عدم پذیرش نمونه:
جمع آوری نمونه ها در شرایط غیر استریل.
سرم، نمونه های فریز شده، نمونه های منعقد شده یا به شدت همولیز شده.
نمونه های جمع آوری شده در ظروف حاوی مواد ضد انعقاد غیر از EDTA (هپارین با غلظت بیش از 10 واحد در میلی لیتر سبب مهار PCR می شود لذا، از نمونه های هپارینه و نیز نمونه بیماران تحت درمان با هپارین نمی توان استفاده کرد).
شرایط نگهداری:
طی چند ساعت اولیه پس از نمونه گیری باید بافی کت نمونه های مورد استفاده جداسازی شده و به حجم های مورد نیاز تقسیم شود و در دمای ºC 20- قرار داده شود و از ذوب و فریز مکرر آنها تا زمان انجام مراحل بعدی آزمایش خودداری شود.
جهت حمل و نقل نمونه خون تام لازم است نمونه در شرایط خنک حمل شود ولی باید از یخ زدگی آن جلوگیری نمود.
خون کامل را می توان حداکثر تا 72 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری و به آزمایشگاه منتقل کرد.
کاربردهای بالینی:
ü در دسترس بودن و سادگی نمونه مورد نیاز (5 میلی لیتر خون محیطی جهت انجام این تست کافی است)
ü سرعت و حساسیت بالا برای ردیابی mRNAی BCR/ABL و بررسی میزان تولید پروتئین P210 در بیمارانی با اختلالات خونی.
ü بررسی پاسخ درمانی و یا میزان پیشرفت بیماری در افراد مبتلا به لوسمی میلوئیدی مزمن (CML) که وجود فیوژن e13/a2 (b2a2) و یاe14/a2 (b3a2) در آنها تشخیص داده شده است.
اطلاعات تکمیلی:
کروموزوم فیلادلفیا (Ph) یک ناهنجاری کروموزومی است که در نتیجه جابجایی متقابل میان کروموزوم های 9 و 22 (9;22)(q34;q11) حاصل می شود. در نتیجه این جابجایی ژن BCR واقع در کروموزوم 22 در مجاورت پروتوانکوژن ABL واقع در کروموزوم شماره 9 قرار می گیرد و یک ژن هیبرید ایجاد می شود. محل شکستگی در ژن ABL نسبتاً ثابت بوده و معمولاً پیش از اگزون 2 (a2) رخ می دهد ولیکن تنوع نقطه شکست در ژن BCR، منجر به ایجاد پروتئین های الحاقی BCR – ABL گوناگونی می شود. در نتیجه این الحاق ها، فعالیت تیروزین کینازی ژن BCR افزایش یافته و با فسفریلاسیون پروتئین های سیتوپلاسمی منجر به تکثیر سلولی، مهار آپوپتوزیس و تغییر چسبندگی، کاهش وابستگی به فاکتور رشد و اثرات دیگر می شود.
تاکنون سه ناحیه شکستگی عمده درون ژن BCR شناسایی شده است که شامل M-BCR (Major-BCR)، m-BCR (minor-BCR) و µ-BCR (micro-BCR) می باشد. M-BCR شامل دو نوع شکستگی است: یکی پس از اگزون 13 (e13) که منجر به ایجاد الحاق e13/a2 (b2a2) و دیگری پس از اگزون 14 (e14) که منجر به ایجاد الحاق e14/a2 (b3a2) می شود. mRNA های رونویسی شده از هر دوی ژن های الحاقی فوق الذکر، به یک پروتئین 210 کیلو دالتونی(P210BCR-ABL) ترجمه می شوند. در m-BCR شکستگی پس از اگزون 1(e1) رخ می دهد و منجر به ایجاد ژن الحاقی e1a2 می شود و در ادامه mRNAی الحاقی حاصل به یک پروتئین 190 کیلو دالتونی (P190BCR-ABL) ترجمه می شود. µ-BCR در نتیجه شکستگی در اگزون 19 (e19) ایجاد شده و به تشکیل ژن الحاقی e19a2 منتهی می گردد که این mRNAی الحاقی به یک پروتئین 230 کیلو دالتونی (P230BCR-ABL) ترجمه می شود.
سرطان خون یا لوسمی یا لوکمیا بیماری پیشرونده و بدخیم اعضای خون ساز بدن است. این بیماری در اثر تکثیر و تکامل ناقص گویچه‌های سفید خون و پیش سازهای آن در خون و مغز استخوان ایجاد می‌شود. لوسمی مزمن میلوئیدی یا به اختصار CML یکی از انواع سرطان خون است که روندی مزمن دارد و در آن سلول‌های مغز استخوان یا میلوسیت‌ها که عامل ساخت بافت‌های مغز استخوان می باشند، تحت تاثیر قرار می‌گیرند. لوسمی حاد لنفوئیدی یا به اختصار ALL از انواع دیگر سرطان خون است که روندی حاد داشته و طی آن سلول‌های لنفاوی یا لنفوسیت‌ها که در ساخت بافت‌های لنفاوی دخالت دارند، تحت تاثیر قرار می‌گیرند.
بیش از 95% افراد مبتلا به CML و در حدود 30% از بیماران ALL دارای شکستگی کروموزومی در ناحیه M-BCR می باشند. m-BCR در مبتلایان به CML کمتر مشاهده می شود ولیکن در 50 تا 70 درصد بیماران مبتلا به ALL یافت می شود. µ-BCR در مبتلایان به CML به ندرت یافت می شود و بیشتر در لوسمی نوتروفیلیک مزمن (CNL) رخ می دهد.
روش مرجع:
ردیابی کمی mRNA با استفاده از روش Real Time PCR (mRNA Detection by RT-PCR Qualitative)
روش ارجح: تعیین میزان بیان ژن الحاقی با روش Real Time PCR
سایر روشها: روش هماتولوژیکی که با شمارش گلبول های خونی و تعیین اندازه طحال صورت می گیرد و روش سیتولوژیکی که بر اساس آنالیز نوارگذاری کروموزوم ها و تشخیص درصد سلول های Ph+ (سلول های دارای کروموزوم فیلادلفیا) انجام می شود ولیکن جهت بررسی پاسخ درمانی و شناسایی بهبود بیماری، روش مولکولی از حساسیت و اختصاصیت بسیار بالاتری نسبت به سایر روش ها برخوردار است.
مقادیر طبیعی:mRNA ی حاصل از ژن الحاقی BCR/ABL در نمونه های حاصل از افراد سالم قابل ردیابی نیست.
تفسیر:
لوسمی میلوئیدی مزمن (CML) نوعی بدخیمی کلونال سلول های بنیادی است که منجر به افزایش رده های سلولی میلوئید، اریتروئید و مگاکاریوسیت در خون محیطی و هیپرپلازی میلوئید در مغز استخوان می شود. بیش از 95 درصد بیماران CML دارای یک ناهنجاری کروموزومی به نام کروموزوم فیلادلفیا می باشند که در نتیجه جابجایی ژن BCR در مجاورت پروتوانکوژن ABL حاصل می شود. بررسی کمی و کیفی کروموزوم فیلادلفیا نقش مهمی در تخمین پاسخ درمانی و پیش بینی میزان پیشرفت بیماری دارد. ژن BCR-ABL دارای واریانت های متفاوتی است ولیکن دو نوع b2a2 و b3a2 از بقیه شایع ترند.
در حال حاضر روش Real time PCR به عنوان یکی از دقیق‌ترین و سریع ترین روشها جهت تشخیص و بررسی میزان رونوشت های ژن BCR-ABL در نمونه های خون محیطی بیماران شناخته شده است. جهت انجام این تست، ابتدا به کمک روش RT-PCR و با استفاده از RNAی استخراج شده از خون محیطی بیمار، cDNA ساخته می شود و در ادامه به وسیله پروپ‌های هیبریدی و پرایمرهای اختصاصی DNA تکثیر می یابد. طی این آزمایش هر نمونه از نظر وجود mRNA برای دو ژن BCR-ABL (MBCR) و ABL بررسی می شود لذا، باید دو آزمایش PCR در لوله های جداگانه انجام شود. 5 استاندارد برای ژن MBCR و 3 استاندارد برای ژن ABL در هر تست PCR همراه با نمونه بیماران مورد استفاده قرار می گیرد و تعداد کپی های cDNA نمونه بیمار بر اساس نسبت منحنی استاندارد ژن BCR-ABL به ژن ABL تعیین و سنجیده می شود. لازم به ذکر است که جهت افزایش دقت در هر بار آزمایش، یک نمونه دو بار مورد بررسی قرار می گیرد و برای اطمینان از عدم ایجاد آلودگی و نتایج مثبت کاذب یک نمونه کنترل منفی برای هر یک از ژن های BCR-ABL و ABL در هر آزمایش مورد بررسی قرار می گیرد.
عوامل مداخله گر :
هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.
نمونه گیری، جداسازی بافی کت و انجام سایر مراحل آزمایش در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.
برای جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب باید فضاهای مربوط به استخراج RNA، آماده سازی مواد مورد نیاز واکنش و فضای افزودن نمونه DNA به لوله PCR از هم جدا باشند.
توضیحات:
نتیجه «Undetected» نشان می دهد که رونوشت ژن هیبرید BCR-ABL درنمونه یافت نشده است.
نتیجه مثبت وجود کروموزوم فیلادلفیا را در نمونه مورد آزمایش تائید می کند.
نتیجه منفی امکان وجود کروموزوم فیلادلفیا را رد نمی کند. چرا که فاکتورهایی همچون تجزیه اسید نوکلئیک یا تداخل بعضی از مواد با آمپلیفیکاسیون ممکن است وجود داشته باشد.
برای ارزیابی پاسخ درمانی هر بیمار تحت درمان، باید نسبت میزان بیان BCR-ABL (MBCR) در زمان تشخیص (پیش از درمان) به میزان بیان آن پس از درمان محاسبه شود. لازم به ذکر است که میزان بیان BCR-ABL (MBCR) ابتدا باید نسبت به میزان بیان ABL سنجیده شود.
