نام اختصاری: Brucella PCR
سایر نام ها:
Brucella DNA Detection, Brucella Detection by PCR, Brucella Polymerase Chain Reaction (PCR)
بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)
نوع نمونه قابل اندازه گیری: خون تام
حجم نمونه مورد نیاز: 5 ml
شرایط نمونه گیری:
نیاز به ناشتایی نمی باشد.
نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.
ملاحظات نمونه گیری:
لازم است نمونه گیری در شرایط استریل و در لوله های جمع کننده یا پلاستیکی استریل و یا لوله های حاوی ماده ضد انعقاد صورت گیرد.
ماده ضد انعقاد مورد نیاز برای جمع آوری پلاسما می تواند EDTA یا سیترات باشد.
پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.
از لوله های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.
پس از نمونه گیری باید لوله حاوی نمونه سانتریفیوژ شود و در ادامه پس از جدا سازی سرم یا پلاسما، بلافاصله نمونه در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج RNA و PCR می باشد، در20ºC – نگهداری شود.
محل نمونه گیری از لحاظ خونریزی بررسی شود.
در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود.
موارد عدم پذیرش نمونه:
نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل.
قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه.
در این آزمایش از نمونه های هپارینه نمی توان استفاده کرد (هپارین با غلظت بیش از 10 واحد در میلی لیتر سبب مهار PCR می شود). همچنین نمونه بیماران تحت درمان با هپارین نیز برای PCR مناسب نیست.
شرایط نگهداری:
جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط خنک حمل شود ولی باید از یخ زدگی آن جلوگیری نمود.
خون کامل را می توان حداکثر تا 72 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری و به آزمایشگاه منتقل کرد.
در صورت نبود شرایط مناسب برای انتقال نمونه در 24 ساعت اولیه، لازم است نمونه را به حجم های کوچک یک یا دو میلی لیتری تقسیم نموده و در 20oC – فریز نمایید.
کاربردهای بالینی:
تشخیص صحیح و به موقع عفونت بروسلوز جهت کنترل و درمان بیماری و پیشگیری از بروز عوارض ناشی از آن
اطلاعات تکمیلی:
بروسلا ها باکتری های گرم منفی داخل سلولی اختیاری هستند که سبب ایجاد عفونت در حیوانات و انسان می شوند. با این که بروسلوز در برخی کشورهای پیشرفته ریشه کن شد، ولی هم چنان به عنوان یکی از مسائل مهم جهانی باقی مانده است.
بروسلاها می توانند در 80 درصد موارد به صورت مزمن و موضعی در گره های لنفاوی فوق پستانی جایگزین شده و از طریق شیر دفع شوند و با مصرف شیر نجوشیده یا پنیر تازه به انسان منتقل شوند. کشاورزان، دامپزشکان، کارکنان آزمایشگاه و کارگران کشتارگاه ها در معرض خطر آلودگی با بروسلا قرار دارند.
وجود علائم بالینی بسیار غیر اختصاصی و متنوع از یک سو و شیوع عفونت های ساب کلینیکال و غیر تیپیک در مراحل حاد و مزمن از سوی دیگر، تشخیص کلینیکی بروسلوز انسانی را دشوار نموده است. لذا توجه به تأییدات آزمایشگاهی حتی در مواردی که علائم بالینی دلالت بر وجود بیماری بروسلوز دارد، الزامی است. باکتری های خانواده بروسلا می توانند درون سلول میزبان به زندگی خود ادامه داده و سبب عود بیماری و عوارض موضعی شوند. بنابراین تشخیص زود هنگام بیماری و در نتیجه شروع درمان به موقع، می تواند نقش کلیدی را در برنامه های کنترل و مدیریت بیماری بازی کند.
روش مرجع: کشت باکتری
روش ارجح: تشخیص بر پایه روش های سرولوژیک
سایر روشها: روش های تشخیص مولکولی بر پایه PCR
مقادیر طبیعی: DNA ی باکتری بروسلا در نمونه های حاصل از افراد سالم قابل ردیابی نیست.
مقادیر مرجع: ردیابی DNA ی باکتری با استفاده از روش Conventional PCR انجام می شود. بنابراین، میزان DNAی باکتری در نمونه مورد آزمایش باید به اندازه ای باشد که پس از تکثیر توسط واکنش PCR به روش کیفی، قابل ردیابی توسط الکتروفورز روی ژل آگارز باشد.
تفسیر:
علائم بالینی بروسلوز بسیار غیر اختصاصی بوده و نیز ممکن است بسیار متنوع باشد و به همین علت تشخیص بیماری نیازمند تأییدات میکروبیولوژیکی از طریق جداسازی میکروب و یا ردیابی آنتی بادی های اختصاصی به وسیله تست های سرولوژیکی می باشد.
تشخیص آزمایشگاهی بروسلوز بر اساس کشت خون مثبت و تست های سرولوژیکی انجام می شود. تکنیک های کشت وقت گیر بوده و فاقد حساسیت لازم در بیماران مبتلا به عفونت مزمن می باشد. از طرفی سر و کار داشتن با این ارگانیسم در آزمایشگاه مخاطره آمیز است. روش های سرولوژیک مرسوم در بیماران با عفونت های مزمن از حساسیت کافی برخوردار نیست و واکنش متقاطع با دیگر باکتری های گرم منفی نیز منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب می گردد از این رو استفاده از روش های مولکولی نظیر PCR توصیه می شود. PCR سریع ترین و دقیق ترین روش تشخیصی می باشد که طی آن باکتری بروسلا به واسطه تکثیر ژنوم باکتری در نمونه خون، مغز استخوان، موکوز و یا CSF ردیابی می شود.
عوامل مداخله گر :
هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.
نمونه گیری و جداسازی در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.
فضاهای مربوط به استخراج DNA، آماده سازی مواد مورد نیاز واکنش و فضای افزودن نمونه DNA به لوله PCR، برای جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب باید از هم جدا باشند.
سطوح کار باید همواره قبل از شروع و پس از پایان کار با دستمال آغشته به الکل 70% و یا وایتکس 10% تمیز شود.
توضیحات:
نتیجه «Undetected» نشان می دهد که DNA باکتری در نمونه یافت نشده است.
ارزیابی آزمایشگاهی وضعیت عفونت بروسلوزی عموماً با آزمایشات سرولوژیک آغاز می گردد.
در صورت عدم وجود DNA باکتری در نمونه بیمار و مثبت بودن نتایج تست های سرولوژیکی، احتمال آلودگی به بروسلا رد نمی گردد.
