نام اختصاری: HBV Quantitative Real-Time PCR
سایر نام ها: اندازه گیری کمی ویروس هپاتیت Bبا روش Real-Time PCR، Hepatitis B Quantitation، HBV DNA Quantitation،HBV DNA detection by Real time PCR ، HBV viral Load
بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)
نوع نمونه قابل اندازه گیری: پلاسما، سرم، بافت کبد
حجم نمونه مورد نیاز: 5 ml
شرایط نمونه گیری:
نیاز به ناشتایی نمی باشد.
نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.
ملاحظات نمونه گیری:
لازم است نمونه گیری در شرایط استریل و در لوله های حاوی EDTA صورت گیرد.
پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box ) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.
از لوله های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.
پس از نمونه گیری باید لوله حاوی نمونه سانتریفیوژ شود و در ادامه پس از جدا سازی سرم یا پلاسما، بلافاصله نمونه در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج DNA و PCR می باشد، در ºC 20 – نگهداری شود.
محل نمونه گیری از لحاظ خونریزی بررسی شود.
در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود.
برای تهیه پلاسما از مواد ضد انعقاد EDTA یا سدیم سیترات استفاده شود.
موارد عدم پذیرش نمونه:
نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل.
قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه.
در این آزمایش از نمونه های هپارینه نمی توان استفاده کرد.
شرایط نگهداری:
پس از جدا سازی سرم یا پلاسما در شرایط استریل، باید تا زمان انجام آزمایش، آن را در دمای ºC 20 – نگه دارید. سرم باید طی چند ساعت اولیه پس از خون گیری از لخته جدا شده و به صورت منجمد نگهداری شود. بافت کبد نیز باید تا زمان انجام آزمایش های بعدی در oC 20 – نگهداری شود.
جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط سرد حمل شود.
در صورت نبود شرایط برای انتقال نمونه در 24 ساعت اولیه، نمونه را در oC 20 – فریز نمایید.
کاربردهای بالینی:
تأیید عفونت مزمن ویروس هپاتیت B ( (HBV
تعیین کمی HBV-DNA سرم بیماران مبتلا به عفونت مزمن HBV (سابقاً HBsAg مثبت بوده اند.)
نظارت بر پیشرفت بیماری در عفونت HBV مزمن و یا پاسخ به درمان ضد HBV
اطلاعات تکمیلی:
هپاتیت ویروسی مزمن ممکن است ناشی از عفونت با HBV یا HCV باشد. عفونت ممکن است منجر به یک حالت ناقل طولانی مدت و بیماری کبدی مزمن خفیف تا شدید شود. دو هفته پس از عفونت با هپاتیت B، میتوان مقدار زیادی از پروتئین ویروس (آنتیژن سطحی ویروس) را در سرم و پس از آن پاسخ آنتیبادی به پروتئینهای ویروس (anti-HBs) را ردیابی کرد. آنتیبادیهای ضد HBV در اکثریت بیماران برای تمام عمر پا بر جا میمانند. بهرحال حدود 10% از عفونتهای HBV منجر به یک حالت ناقل مزمن میشود که مشخصة آن فقدان anti-HBs است ولی anti-HBc و معمولاً HBsAg باقی میمانند. تشخیص این گونه موارد باید با ردیابی HBV DNA در سرم یا بافت کبد تکمیل شود.
روش مرجع: Blot DNA Hybridization Based – Slot
روش ارجح: DNA Detection and Quantification by Real-Time PCR
سایر روشها: Qualitative DNA Detection Real-Time PCR، تکثیر DNA با استفاده از روش PCR Conventional.
مقادیر طبیعی: DNA ویروس HBV در نمونه های سرم یا بافت کبدی افراد سالم وجود ندارد و ردیابی نمی شود.
محدوده قابل سنجش (مثبت): IU/ml 109 × 25 – 5
تفسیر:
کاوش پروبDNA ، یک اندازهگیری مستقیم HBV در سرم یا پلاسما را امکانپذیر ساخته و با تیترهای آلایندگی (infectivity) ارتباط دارد. اطلاعات حاصله از این آزمایش باید همراه با تستهای سرولوژیک و ردیابی HBsAg مورد استفاده قرار گیرد HBV DNA حساسترین مارکر برای عفونت جاری (ongoing) است. اندازهگیری کمی DNA ویروس ارزش پروگنوستیک داشته و از آن به عنوان پاسخی به درمان ضد ویروسی استفاده میشود. همزمان با پاک شدن عفونت از بدن، سطوح HBV DNA و HBsAg افت میکند. در مراحل بعدی بیماری که آمینوترانسفرازها طبیعی میشوند، DNA ویروس با تکنیکهای هیبریداسیون منفی میشود ولی غالباً با PCR قابل ردیابی خواهد بود. ردیابی DNAنباید جای آزمایشات سرولوژیک را بگیرد.
عوامل مداخله گر :
هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.
نمونه گیری و جداسازی پلاسما یا سرم در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.
توضیحات:
نتیجه «Undetected» نشان می دهد که DNA ویروس هپاتیت (HBV) B در نمونه یافت نشده است.
نتایج کمی بیان شده به واحد IU/ml نشان دهنده میزان فعالیت ویروس HBV و تکثیر آن در بیمار است.
نتایج کمی بر پیشرفت بیماری در عفونت HBV مزمن و یا پاسخ به درمان ضد HBV نظارت می کند.
ارزیابی آزمایشگاهی وضعیت عفونت HBV باید با آزمایشات سرولوژیک HBV آغاز گردد. از جمله، آزمایش از نظر وجود آنتی ژن سطحی هپاتیت B مورد ارزیابی قرار گیرد.
تشخیص عفونت مزمن HBV صرفاً با حضور مقادیر قابل تشخیص و سنجش DNA ویروس در نمونه سرم امکان پذیر نیست.
در صورت عدم وجود DNA ویروس در نمونه سرم بیمار و مثبت بودن Anti HBs، احتمال آلودگی به ویروس HBV رد نمی گردد.
